| 早稲田キャンパスにおける生物と環境を探る Ⅱ 小泉美香 |
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東巴のギャラリー ２  |
| Ⅱ. MRIのお話 |
| 植物の先端機器観測 |
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Ⅰでは古典的な植物群の観測法として、非常に優れた側面を持つ門司・佐伯の理論と、その応用について話をしました。実際は、もう少し、異なる方向から同理論について考察しておきたいのですが、未だ、予定している具体的な例について明快な論理を構成できていません。そこで、一度、現代の技術的進歩がもたらした植物生態学にも応用可能な生物学の新観測法について話を進めます。 秤と物差しで何でも済ませてしまおうとする生態学にも、物理計測機器が否応なしに侵入してきて数学や物理が嫌いで生物学にきた私も、計測の理論など解らないのに物理測定機器を操ることになりました。そして、たまたま、触れるチャンスが訪れたのは非破壊的、かつ、ビジュアルであるという現代流行の落とし子、コンピューターのお化けのようなMRIでした。 |
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１．MRIを通した植物機能の可視化 植物の観察は、肉眼による観察とスケッチを基礎にした博物学から出発したと考えられます。博物学の意義は、植物に対する知識を蓄積して分類することが、食糧、医薬品、環境保全という面で、人の生活に大変役に立つところにありました。やがて、観察そのものが精密化され、理論化されました。その一段階がⅠで話した植物群落についての生産構造の解析です。 博物学の基礎である形態観察においても、肉眼と観察対象の間に、拡大鏡、顕微鏡、高感度カメラ、デジタルカメラというように、直感的に利益が分かる観察用の装置が介入してきました。その上に、最近は画像解析器が割り込んでいます。このような装置を通しても「形態の情報を捉える」という目的は変わりませんでしたが、分類のための調査項目である組織形態に付随する機能の観測においては、新しい方法が取り入れられ、多くの手法が開発されました。例えば、ビデオカメラは植物の発芽などの生長をリアルに捉えていますし、組織の機能は蛍光、蛍光色素あるいは蛍光抗体を用いた追跡が多く研究に採用されています。その他にも機能研究の手法には、X線－CT、アコースティックイメージング、サーモグラフ、MRIなどがあります。 このような1990年以降の特に電子技術の発達がもたらしたものは、「科学＝数表化」から、「科学＝可視的表示＋経過シミュレーション」という方向への科学哲学の変化だと思います。 |
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MRIは、医療における診断法のひとつとしてよく知られていますが、その基礎は、NMR（核磁気共鳴）シグナルに位置の情報を与える操作をして、測定対象の内部情報を画像化する方法です。 NMR顕微鏡といわれる分解能が高いイメージング装置が研究所に導入されたことがキッカケで、私は1989年にMRIを始めました。もちろん、理論を理解するなぞということはほとんど不可能で、名前を呼ばれたら、先ず、「デッキませーん」と大声で懸命に叫んだのですが。ここでは、周りの人たちに小突かれながら行ったMRIによって植物の組織形態と機能を観察するという話題を紹介します。特異性が高い有用な手法なのに、研究者があまりいないという点では話をしておく意味があると思います。 MRIといっても医療におけるような診療の意味を持っているものではありません。植物研究におけるMRIは、顕微鏡と同じように植物の組織の一部を可視的に捉えるための手段です。 顕微鏡とは次の点で違っています。 （１）試料調製（プレパラート作製）を必要としないで、植物の内部組織を非破壊的、かつ、立体的に観察ができる。反対に、 （２）イメージの分解能は最高でも50 μm程度と、顕微鏡（1 μm）に対して遙かに劣る。 そこで、MRIの非破壊的観察という特徴から出発して、分解能が劣るMRIにはどのようなメリットがあるのか？何が他の手段では変わることができない特徴か？について話を進めます。 |
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２．NMR （核磁気共鳴） 先ず、測定の原理をできる限り簡単に話します。 MRIのシグナル源はNMR（核磁気共鳴）という現象に基づく信号です。NMR信号に「試料のどの部位からシグナルが得られたか」という位置の情報を与えたのがMRIイメージです。だから、NMRシグナルの原理と、NMRからMRIへどのようにして変化させるのかという技術的課題を理解するようにして下さい。 化合物に含まれる水素原子核、すなわちプロトン（Fig. 1の赤丸）は、コマのように回転していて、小さな磁石のような性質を持っています。 試料をNMR装置の強力な磁石の間に置くと、プロトンは磁場に向いて歳差運動をします。つまり、コマのように軸を中心に回転（スピン）をしながら、軸自体も首振りの回転をします。生物は水（H2O）、糖(nCH2O)、脂質(CH3(CH2)nCOOH)などの化合物で形成され、それらの化合物の構成要素であるプロトンが多量に含有されています。よって、生物組織を強い磁場の中に置くと、沢山のプロトンスピンが磁場の方向に整列します。その時、バラバラな位相で歳差運動をするプロトンスピンを全体としてみると、歳差運動が平均化されて磁場（Z軸）方向に紺の矢印で示した磁化が形成されると考えることができます。 |
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そこへ、ラジオ波を照射すると、磁化は回転位相を揃えてX-Y平面へと倒れます。90度倒したところでラジオ波を止めると全磁化はX-Y平面を同じ速度で回転します（白い楕円と矢印）。その時、平面に直角に検出コイルを置いておくとコイルに誘導電流が流れます。これがNMR信号です(Fig. 2)。 電流は磁化がコイルと直角に回転することで誘導されますが、磁化は縦軸の磁力に引かれて時間とともに磁場方向へ戻っていき検出コイルに対して平行成分が生じ、コイルに直角に回転する成分（横成分）によって発生する電流量が少なくなるためにNMR信号が検出できなくなります。90度倒れた磁化が磁場（Z軸）方向に戻って電流が流れなくなる速度を表す時定数がT1です。 T1の概念は、磁化が1/2 回復する時間の1.41倍を表しています。 |
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上で述べた誘導電流の検出について回転系の概念を導入します。 ラジオ波を受けてX-Y平面に倒れた磁化はX-Y平面で回転していますから、コイルに誘導される電流は交流です（Fig. 3Aの臙脂色の線）。それを磁化と同じスピード（周波数）で回転しながら観測する場合（回転座標系）を考えると、磁化は常に検出コイルの前（Fig. 3Bの目の位置）にいると考えて良いことになります。ラジオの受信と同じで、これを位相検波といいます。 試料に含まれている沢山のプロトンスピンの集合である磁化においては、各スピンは場所によって少し不均一な強さの磁場の中で回転している、言い換えると、各々のスピンは少しずつ異なる周波数で回転していますから、時間とともにラジオ波によって強制的に与えられた中心周波数と実際の回転のズレが拡大し、スピン密度が分散します。これは、目の前で見える磁化の密度分布がFig. 3Cのようにt1からt5へと変化してピークが低くなることを意味します。その結果、電流を誘導できる磁化の大きさ（密度のピーク）が減り、シグナルが見えなくなります。スピン密度が分散してコイルに電流が流れなくなる速さを表す時定数をT2と言います。このスピン密度の分散時間は、T1より著しく短く、また、装置面から考えて電流検出の時間に比べてかなり速く起こります。 |
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試料は、磁石内の磁場強度に部位的な不均一性を発生し、シグナルのT2減衰を著しく速くします。とくに磁場を乱す性質を持っている生体試料の測定では、検出する前にスピン密度が分散してシグナルを捉えられない場合があります。そこで、スピン密度の分散を補正する方法が考えられています。 Fig. 4Aには測定操作として与えるラジオ波の系列（シークエンス）とスピン回転位相の分散を示します。ラジオ波を当てて、90度、磁化を倒します。ラジオ波で強制的に一定の回転位相を与えるので、倒した直後は位相が揃っていますが、時間がたつに従って、スピンの位相が少しずつずれてスピン密度は分散し、シグナルは観測できなくなります。そこで、τ時間待って、再びラジオ波を当て、今度は、180度磁化を倒します。これによって磁化の回転は反転し位相の移動方向が逆転して、分散していった位相は集結する方向に動きます。そして、2τ時間後に、スピン位相が集結して密度が最大になります。これをエコーといい、最初の信号強度をかなり回復することができます。エコーが発生するタイミングでシグナルを取り込むことによって、スピン密度の分散が速い試料のシグナルを検出することができるようになります。この90度－180度パルスで特徴付けられるラジオ波の照射系列をスピンエコー法といいます。イメージングに限ったものではありませんが、生体試料を扱うMRIで良く用いられるシグナル検出法ですから記憶しておいて下さい。 |
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３．MRI（磁気共鳴画像法）の原理 MRIでは、ラジオ波を照射して励起した後、NMRシグナルを検出するまでの間に磁場勾配を与えることによって、磁化に位置の情報を与えます。そして、位置毎に区別して検出したシグナル強度を、検出した位置に戻してマップすることによってイメージを作成します。 Fig. 5Aのような試験管に入れた水を試料にして、高さ方向の中央横断層（水色）のイメージを測定する場合を考えます。磁場勾配はX軸、Y軸およびZ軸で異なった方法で掛けられます。Fig. 5Bは磁場勾配（緑線）とシグナルを取り込む（上向紫矢印）タイミングです。話の都合でZ軸、Y軸、X軸の順番で磁場勾配が持つ意味を説明します。 Z軸方向に加えられる磁場勾配（Gz）をスライス磁場勾配と言います。長い試験管のうち、高さ方向の特定位置（スライス：ガラス管の破線断層）のシグナルだけを取り出してくるために加える磁場勾配です。 Y軸方向の磁場勾配（Gy）は、シグナルを取り込む毎に段階的に強度を変えて加えながら、決められた回数シグナル取得します。これを位相エンコードと言い、潜在的にY軸位置情報を磁化に与えます。取り込んだシグナルを集めてフーリエ変換するとY軸位置のシグナルが得られます。 X軸方向の磁場勾配（Gx）は、エコーシグナル取得のタイミングで加えられ、リードエンコードと言われます。取り込んだ後、シグナルの周波数を調べるとX軸のどの位置から得られたシグナルであるかということが分かります。 |
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Fig. 5のZ、Y、X軸の磁場勾配の意味をイメージと対応させて考察します。 Gzのみを加えてシグナルを定められた回数取り込んでフーリエ変換するとFig. 6Aのような点を表すイメージが得られます。このデーターを、強度を縦軸に取ってサーフェースプロットという方法で表示すると、測定断層にある水分子のシグナルが得られます(Fig. 6A下)。シグナルに位置の情報は与えられていません。実際は、広いケミカルシフト領域で測定されたスペクトルを表しています。 GzとGyを加えて決められた回数シグナルの取得を繰り返して一組として、フーリエ変換するとY軸方向に直線のシグナルが現れます(Fig. 6B)。イメージではY軸における水が存在する位置にシグナルが縦の線になって表示されます。サーフェースプロットをすると、スペクトルを縦に並べた形になって、スペクトル強度はY軸位置に存在する水の量に比例します(Fig. 6B下)。 Gz、Gy、Gxを加えて、定められた回数シグナルを取り込んでフーリエ変換すると、X軸の位置情報が加わって水の入った試験管の断層イメージになります(Fig. 6C)。位置の変化は著しく大きいので、サーフェースプロットをするとケミカルシフトの影響は消失してシグナル強度を表す円柱形となります(Fig. 6C下)。試験管の水は位置的に量が一定なので、本来的にはトップに凸凹がない円柱形になるはずですが、この場合は鞍のようにへこんだ部分が認められます。これは、照射するラジオ波に不均一性があるためだと思われます。 |
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４．MRIの装置 MRI装置のブロックダイアグラムを示します(Fig.7)。装置は磁石、検出コイル、および、磁場勾配コイルを持つ検出器部分、ラジオ波の送受信機、磁場勾配制御器と磁場勾配電源、そして、制御用コンピューターからなる分光器部分、および、測定制御およびデーター制御をするコンソールで構成されています。 別の見方、すなわち、役割という側面で見ると、 （１）静磁場を発生する磁石 （２）シグナルを検出するための検出コイルとラジオ波送受信機 （３）イメージを構築するための磁場勾配コイルと制御器 （４） 心臓部のコンピューター （５） 制御命令の表示装置 に別けることができます。このうちで信号に関わる（２）と（３）はそれぞれ別の意味を持っています。すなわち、（２）はNMR信号を検出する部品、（３）は信号に位置の情報を与えてイメージを構築する部品として働きます。このように、原理の部分で、NMR信号検出とMRIのイメージ構築を区別して説明したことと対応した構造で装置が組み立てられています。 |
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実際のMRI装置にはFig. 8のような異なった形式の装置があります。 上の装置は、私が2010年ころまで使用していた超伝導磁石を備えたNMRスペクトロメーターで、普通には精製（単離）化合物の同定や構造決定に使用されます。上左の超伝導磁石は液体ヘリウムによって低温に保たれて非常に安定で高い磁場を発生させることができます。上右は分光器で、装置のコントロールはワークステーションによって行われ、かなり高度な測定が可能です。さらに、写真の装置にはMRIイメージ測定を行うためのアタッチメントが装備されていました。安定で検出感度が良いので高い分解能（50 μm）のイメージを得るために使用され、NMR顕微鏡と呼ばれています。ただし、測定できるサンプルはせいぜい直径30 mm程度までの試料です。 下は、病院に設置されている医療診断用の超伝導磁石のMRIです。リング状の部分が磁石で、人が寝台に横になって、マグネットの中に入ります。普通には測定操作のためのコンソールはガラス窓の外に設置します。 これらの装置は大がかりで、設置するためには専用の部屋や施設が必要です。 |
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余談ですが、最近は、私は高性能なNMR顕微鏡に見放され、Ⅰで話した頑固な老人が、１０年前の携帯電話のように単純なMRI装置を作ろうと言って作った小さな永久磁石の装置を使っています。 MRIは、通常、Fig. 8の写真のように大がかりな装置ですが、ブロックダイアグラム(Fig. 7)に示した部品があれば作ることができるので、磁石を小さな永久磁石にして、ラジオ波の送受信機と磁場勾配制御器を付けて、ワークステーションのかわりにWindowsのパソコンでコントロールするMRIを制作して貰ったのがこのMRIです(Fig. 9)。 MRIの測定には少し時間が掛かるので、明るい通常の研究室に置いて論文を書きながら、顕微鏡を観るようにイメージを取ることを狙ったようです。測定できるサンプルのサイズは直径30 mm以下です。このサイズは意外に小さく、ちょっとした野菜や果物を観察しようと思うと、大抵は大き過ぎて入りません。さらに、磁場強度が低いので、感度はあまり高くありませんが、安定であり、100 μm程度の分解能を出すことができます。 パーソナルコンピュータならぬパーソナルMRIだと威張っていますが、携帯電話のカメラ程度には使えますし、家庭用電源で使える、運搬できるなど、他にないユニークな装置です。一番重宝しているのは帰るときにシャットダウンできることです。装置は早稲田においてあります。 |
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Fig. 9のMRIは、分解能はそこそこ高いけど、直径30 mmの試料までしか測れないところが不満の種でした。そこで、磁石（Fig. 9A）を変えて、リンゴの大きさくらいなら楽に測れるようにして貰いました。ただし、分解能は大分落ちて、拡大鏡くらいになります。MRI分光器(Fig. 9B)も新しくしてモダンになりましたが、Windows コンピューターを使っていることも性能もほとんど同じです。 時折、NMR顕微鏡の分解能は低いので顕微鏡などとは言えないという話を聞きます。NMR顕微鏡の分解能50 μmは大きな細胞程度で、実体顕微鏡程度の観察ができます。一般には大きな物を観察するときは試料のサイズに対する分解能を考えれば良いので、磁石の空間をボアと言いますが、MRIイメージの分解能はボア（視野の最大サイズ）を128あるいは256で除した程度、すなわち、視野を16000～64000画素で観察していると考えることができます。 |
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MRIでは、 性質として水分子の存在位置を検出する。 その結果、入れ物である組織の形が非破壊的に観察できる、と考えられていますが、これはMRIの本質の一部です。 固体構造ではなく、水分子（内容物）を通して組織（パッケージ）の形態を観察するので、 イメージがボケテいるし、また、分解能が顕微鏡に比べて著しく劣る という欠点があります。 反対に、水は生体反応のマトリックス（場）となっているので、水分子の状態を通して その時点における細胞の生理を観察できる、また、組織の機能をリアルに可視的に観察できるという長所を持っています。 このように、観測において何を観ているのか？を明確に捉えておくことが最も重要です。その上で、自分の目的に応用できるか？を考察する必要があります。 ここまでMRIはどのような装置かということを述べました。次のセクションではMRIはどのように使用されるかについて話をします。 |
| MRIによる植物のイメージング |
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５．光学的観察手法（顕微鏡、カメラ）との比較 観察の基本は、何が見えるのか？を明確に把握することです。 MRI： （１）生物組織内のプロトン核を含んでいる化合物を非破壊的に検出する 生物組織においてプロトンを含む化合物は、主に水と油脂分子です。 （２）水分子と油脂分子の量と運動性のマップを作成する 活動する生物の身体は50から80%が水であり、植物では90％近くにもなることがあります。 ですから、水の分布と運動性をマッピングするということは、 （３）生物体内の水の性質が異なる組織が描写される よって、近似的に解剖学的組織が描かれます。 顕微鏡などの光学的形態観察手法： （１）固体構造による光の屈折、吸収、散乱を観測する （２）生物体内の解剖学的組織そのものが描写される という違いがあります。 光学的方法は高い分解能と実体的形態の描写が可能であるのに対して、MRIでは水の分布を通した入れ物の形態の描写しか出来ないというデメリットがあります。しかし、光学的方法は光が当たる面の画像しか得られませんが、MRIでは内部組織の画像が非破壊的に得られる、というメリットがあります。 非破壊的組織の観測がMRIの最大の特徴であり、また、医療に効果的に応用された理由です。 |
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６．MRIのイメージ MRIでは測定条件がイメージのコントラストに大きな影響を与えます。そこで測定シークエンスと条件（TRとTE）の関係から話を再開します。イメージ測定にはNMRシグナルを得るためのラジオ波（RF）のシークエンスと、シグナルに位置情報を与える磁場勾配のシークエンス（Gx、Gy、Gz）が必要です。通常、シグナルはエコーとして得られますが、スピンを倒すラジオ波（90°)からエコーの発生までをエコー時間（TE）と言います。画像を構築するためにはシグナルをY軸位置の刻み分（8の倍数）、磁場勾配の強さを変えて繰り返し取り込みます。一度、90°ラジオ波を照射してから、次のシグナル取得のためのラジオ波を照射するまでの時間を繰り返し時間（TR）と言います。このTRとTEを測定条件と言います。 シグナル強度 (Is) と測定条件の間には、 Is = Np[12exp {-(TR- TE/2/T1)} +exp ( -TR/T1)]*exp (-TE/T2) の関係があります。通常の測定では、TR >> TEのように設定するので Is = Np* [1exp(-TR/T1)] *exp (-TE/T2) となり、シグナルが独立してexp (-TR/T1)、exp (-TE/T2)の影響を受けることが分かります。TRとTEは測定者が任意に選ぶことができるので、この性質を使ってイメージに適切なコントラストを与えます。反対に考えるとイメージのコントラストは組織毎の水の量の違いに基づいて表れますが、それだけでなくT1、T2という水分子の運動性の影響を強く受けることが分かります。 |
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測定条件であるTRとTEを変えると、イメージのコントラストがどのように変化するか？ を説明するために、キュウリの果実のイメージを示します。 上段がTRを5秒、中段はTRを1秒、下段はTRを0.5秒に設定し、左からTEを7ms, 40ms, 80ms, 120msとのばして測定したイメージです。条件の組み合わせによって、同一のキュウリの見え方が変わります。そこで、TRとTEの組み合わせをランダムに変化させ、観察したい組織が明瞭に捉えられる組み合わせを探すことが必要となります。医療においても、そのような手法が用いられていて、これを条件の最適化と言います。 （１）縦左列において、TRを短くして取ったイメージは、T1強調イメージと呼ばれ、水の運動性が低い組織が強調される、と言う性格があります。 （２）また、横上段において、TEを長くして取ったイメージは、T2強調イメージと呼ばれ、水の運動性が高い組織が強調されます。 T1強調イメージでは、表皮と維管束、そして種と果肉の間の組織が強調されました。これらの組織に存在する水の運動性が低いことを示しています。 T2強調イメージでは、種子と、維管束が強調されました。よって、種子と維管束に存在する水の運動性は高いことが分かります。 |
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前の結果をよく見ると、T1強調イメージでも、T2強調イメージでも、維管束が強調されています。これは矛盾です。その理由を検討するために、果実の先端の方について、顕微鏡写真とMRIイメージを比較してみました。 AとBは、キュウリの維管束周辺の顕微鏡写真です。キュウリは複並立維管束といって、中央に空洞化した導管が存在して、それを内側と外側から挟むように篩部組織が並んでいるという構造を持っています。 ここで、顕微鏡写真とMRIイメージを比較すると T1強調でハイライトされた運動性の低い水が存在しているのは導管である、 T2強調でハイライトされた運動性の高い水が存在しているのは篩管である、ことが分かります。 このようにMRIでは測定条件を変えるとイメージが大きく変化するので、条件を変えて測定した結果を総合しないと解剖学的組織形態を明らかにすることが出来ません。しかし反対に、組織の性質を知っていれば、根から運ばれた水を輸送する道管と、地上部から送られてくる光合成産物を運ぶ篩管を区別して描写することが可能です。このように、MRIでは、組織および器官の機能と結びついた画像が得られるという特徴があります。 |
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7．形態と機能－維管束を流れる水 MRIでは形態と同時に機能的な側面を捉えることができます。トウモロコシの幼植物において、茎の中を流れる水の様子を見た結果を紹介します。 左はトウモロコシの幼植物の茎の横断面のイメージで、水の分布を示しています。分解能は20μmです。MRIの分解能は最大でも10 μm といわれているので、MRIとしてはかなり高い分解能です。1細胞の大きさがおよそ100 μm とすると、1細胞の１／５程度です。しかし、顕微鏡写真の分解能は1μmとされていますから分解能という点では顕微鏡写真にかないません。しかし、両者を重ね合わせると良く一致します(右)。ですから、MRIによって形態が見えると言うことは保証できると思います。 MRIのイメージは水の分布を観察しています。このイメージでおもしろいのは、葉に存在している水は、葉の横方向に均一に広がっているわけではなく、維管束から葉の表と裏の方向に固まりを作って広がっているように見えることです。 |
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このトウモロコシの茎中における水の移行を観察します。そのために、マンガンをトレーサーとして使用する測定法を説明します。 マンガンは植物によって良く吸収される微量要素であり、マンガン溶液に根を浸すと水とともに植物体に吸収されて、蓄積されます。矢印の位置を測定するとした時、その位置のマンガン濃度は時間とともに図のように高くなっていきます。マンガンイオンは水の緩和時間を短くする性質を持つので、短目のTRで測定すると、特定のマンガン濃度の時にシグナル強度が高くなり、それよりマンガンが濃くても薄くてもシグナルは観測できなくなります。ですから、TRをうまく設定すると、一定のマンガン濃度に達した組織をハイライトして観察することができます。そのような性質を持つ化合物を造影剤といいます。 右に示したのは、水および濃度が異なるマンガン溶液を試験管に入れて測定したMRIイメージです。TRを5秒にして測定すると、0.1 mMのマンガン溶液のシグナルが一番強く、濃度が濃くなるほど、MRIシグナルは消えていきます。またTRを0.5秒にすると、0.3 mMが一番強いシグナルを示して、それより濃度が低くても、高くても、シグナル強度は低くなります。 このようなマンガンをトレーサーとして用いて根から吸収された水が移動する経過を追跡したのが次のスライドです。 |
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トウモロコシの茎の同じ場所を、時間を追って測定したイメージです。下のイメージ（B）はTRを長く（5 s）して測定した結果です。はじめは白いシグナルが全体を覆っています。これは茎に存在している水のシグナルです。4 hでは、第一本葉周辺でシグナルが薄くなり、マンガンを吸収して水の緩和時間が短くなり、そのためにシグナルが弱くなったことがわかります。その後も中心から外に向かってシグナルが消えていきました。これがマンガンの本質的作用ですが、このように、シグナルが消えていく場合、どこから吸収が進んでいるのか、場所を詳細に特定することは難しいのです。しかし、測定条件を変えると場所の特定が容易になります。 上のイメージ（A）はTRを短く（0.5 s）したT1強調イメージで、前で説明したようにマンガンが一定濃度まで吸収蓄積された場所に強いシグナルが現れます。マンガン吸収開始から2 hで、矢印で示した第１本葉の維管束に強いシグナルが現れました。4 hでは、強いシグナルは第１本葉全体と第２本葉の中肋に認められました。しかし、6 hでは、これらの組織のマンガン濃度は高くなりシグナルが消失しました。一方、鞘葉の維管束と第３本葉の中肋に強いシグナルが出現しました（矢印）。8 hでは、第３本葉のシグナルも消失して、鞘葉ではシグナルが維管束から葉身へと広がって行く様子が観察されました。 このように、トレーサーを上手く使うことによって、維管束の機能を観察することができます。 |
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８．イメージ変化に観る生長 組織において細胞の水（細胞質）は生体反応、代謝、物質移送、生合成などの場（マトリックス）を形成しています。ですから、理屈では、 細胞質の水の量 ： 代謝のマトリックスの容量 細胞質の水の運動性： 生体反応の速度 を示すとする考えが成立します。さらに、 水の長距離移送： 植物体全体の統一性 となりますが、これは後で述べます。 マングローブの胎生種子の発達する過程を観察してみました。 マングローブは、熱帯の汽水域に広がる植物群です。熱帯および亜熱帯の河口付近で、海の水が混ざり合う汽水域で成長し、潮の干満に伴って、水につかったり、水から出たりを繰り返します。このような特殊な環境に生育しているので、マングローブの種子も変わった性質を持っています。 左は、オヒルギというマングローブの仲間の種子です。オヒルギの種子は、母樹に付いている間に発芽をはじめるので、胎生種子と呼ばれます。胚軸をのばし始め、かなり胚軸が発達したところで、母樹から離れて下に落ちます。下に落ちたときに水があれば、水の流れに乗って移動をし、流れ着いたところで根を張ります。下に落ちたときに水がなく、下の土壌に刺さることができれば、そこで根を張ります。 写真は西表島で採取した種子とポットで発根した苗です。 |
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オヒルギの花から胎生種子が発達する過程のイメージ変化を観察しました。開花前（A）のつぼみには、花の根元に大きな蜜溜が認められて、強いシグナルを示しました。また、点のように見える胚珠にも、強いシグナルが認められ、これから種子を作るための準備が始まっていることが分かります。開花して（B）、種子の形成が始まると、種子に強いシグナルが認められました。種子が完成して胚軸が伸長を始める（C）と、種皮と萼以外のシグナルは明確には認められず、胚軸の水は低く抑えられていました。この状態は、胚軸がもう少し伸びたDのステージでも同様で、胚軸の水は低く抑えられたままでした。 このイメージはTR=5 s、TE=36 msの条件で運動性が高い水の量の分布を捉えています。よって、種子内部組織の生理状態を考察することができます。（A）では、蜜溜には固体構造が無いので水は自由に動けるため運動性が高い状態です。（B）では種子が形成されますが、細胞は組織の発達のために代謝活性が高く、生合成による熱発生も高いので、水の運動性は高く保たれます。（C）では種子の形成に続いて胚軸が伸長をはじめますが、胚はすでに形成され、胚軸は母樹から離脱した時に必要な養分を蓄積する貯蔵組織の性質を持つので水の運動性が低く、シグナルは弱くなります。代謝が抑制されていることを示しています。（D）では、胚軸には水のシグナルが検出できませんが、種皮とその内側には水のシグナルが検出され生理活動を停止していないことが分かります。 このようにMRIイメージを基に観察対象の組織の生理状態を推測できることが、MRIが医療において大きなメリットを生んでいる理由の一つです。 |
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さらに、MRIによって、他にどのような生理が分かるか？ を考察します。 サクランボの生長を追ってMRIイメージ（水の分布）、T1イメージ（水の運動性；細胞活性）、果実の中央の細い部分におけるスペクトルイメージ（そこに存在する化合物）の測定について考察します。前の二要素 (水の状態) が代謝活性と繋がっていることはオヒルギの例で述べました。それに加えて、第三の要素は細胞に蓄積する代謝生産物の情報を与えます。 Thirdステージまでは種子に多量に水が存在しましたが、果実の頭部がピンクになるMatureステージ以降は減少しました。反対に、果肉ではThirdステージ以前は水の分布が少ないけれど、Matureステージから増加しました。ステージが進むのにともなう水分布の変化(A)は、水の運動性の変化(B)と対応しています。そして、種子と果肉の水の間には、代謝活性について、互いに対抗する変化が認められました。 スペクトルイメージ(C)は、Matureステージでは果肉に糖(矢印s)が蓄積して、果実が深紅になるRipenedステージでは種子に油脂(矢印o)が蓄積することを示しています。Ripenedステージでは過熟になって果肉の糖は消え、さらに果肉に水が多くなって弾力性を失って食べ頃を逃したことになります。一方、果実の種子が熟すると油脂を蓄積することが分かります。 |
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イメージからは定性的な推定しかできませんが、この画像データーを画像解析して種子のサイズなどのデーターを個別に抽出すると、定量的な解析も可能になります。 イメージを基に、種子と果肉の大きさ、水の量、水の運動性、糖と油脂の量的変化を抽出してグラフにしました。果実の水の状態が変化するのは、種子の サイズの増加が飽和する 水の量が減少する 水の運動性（T1）が低下する Thirdステージであることが分かります。そして、種子は、Matureステージまでにほとんど熟していると考えられます。種子が熟すと急激に油脂が蓄積します。果肉は、それとは反対な変化をするように見えます。Thirdステージ以降、果肉の水が増え、肥大するという呼吸のクリマクテリックライズに対応した変化が認められました。 果実の生理に関する知識を持っていれば、このように、MRIを用いてその時の果実組織の生理変化を推定することが可能です。 |
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９．蓄積化合物の検出 組織に蓄積する糖、油脂など代謝生産物は生理状態を知るための手がかりとなります。それらの化合物を検出してイメージとするためにケミカルシフトイメージング法が開発されています。 Fig. 2-10は、収穫期のブドウ果実 (A) と発芽大豆(B)の1H-NMRスペクトルで水、糖、油脂の蓄積を検出できることが分かります。1H-NMRスペクトルにおいて、糖と油脂はそれぞれ水とは異なるピークになります。 Fig. 2-11はブドウ果実の水、糖、油脂の分布イメージです。試料にグリッドを付けてスペクトルを測定して、後で、コンピューターで水、糖、油脂の部分を区別して取り出してイメージを構築してあります。（a）はT2強調（運動性が高い水だけを検出）を掛けた水のイメージ、（b）は糖のイメージ、（c）は油脂のイメージです。 糖は、水の運動性が低い果肉に蓄積し、油脂は種子に蓄積することが分かります。上の胞室の種子には油脂が認められませんでしたが、胞室周辺の壁に糖が認められるので、種子が未熟なために油脂が蓄積されていないと推定できます。 |
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10．水の運動性と組織の状態 蜜入りリンゴについて組織の状態を、T1およびT2イメージを用いて考察します。蜜入りは寒くなるまで母樹に果実を着けていると、芯の周りの組織が水潤様（写真）になる生理障害であるとされ、果肉が酸欠をおこして腐敗するという意味で欧米では敬遠されて来ましたが、我が国では樹上で完熟した証拠として好まれる傾向にあります。従来、水浸した組織には糖が溜まり甘くなると考えられてきましたが、最近、浸潤した水には甘味が薄いソルビトールを低い濃度で含まれるだけなので、蜜入りそのものが甘いというわけではないとする結果が提出されています。 そこで、MRIの理論に従えば （１）糖が蓄積していれば組織の水の運動性は低くなるので、T1強調イメージで強いシグナルを与える、 （２）糖濃度が低い水が集積しているのであれば、組織の水の運動性は高いのでT2強調イメージで強いシグナルを与える、 と考えてイメージを測定しました。その結果、T1強調イメージでは種子と維管束に沿って放射状に強いシグナルが広がっていました。一方、T2強調イメージでは同じようなパターンで、より広い範囲に強いシグナルが認められましたが、基本的に両者に差がないと思われます。 |
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このT1強調とT2強調の相互に矛盾したイメージをどのように理解するかということを、果実の維管束周辺の顕微鏡写真（写真A）を参照しながら、これまでの果実の生理に関する論文を基にBの模式図を使って考察してみます。 先ず、蜜入りのメカニズムは、 （１）光合成された糖はソルビトールの形で篩管を果実まで転流される。 （２）果実が完全に熟すと、篩管周辺の柔細胞に糖が充満して（Fig. 2-13B; オレンジの細胞）、柔細胞に吸収されなくなった余分なソルビトールは細胞間隙に漏れ出してそこに溜まる（Fig. 2-13B; 篩管周辺のオレンジの斜線領域）。これらの部位はT1強調イメージで強いシグナルになる。 （３）細胞間隙に溢れたソルビトールは高濃度で細胞間隙に溜まり、細胞間隙水の浸透圧を高め、周辺細胞の機能に害作用を及ぼすので、その浸透圧を下げるために導管（Fig. 2-13B; ブルーのキャビティ）から細胞間隙に水が放出される（Fig. 2-13B; 薄いブルーの細胞間隙領域）。その結果、多量な水が細胞間隙に溢出して組織を浸潤し、組織は半透明になる。これらの部位はT2強調イメージで強いシグナルを与える。 |
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さて、少し遊んでみることにします。3Dスピンエコー法でT1強調イメージおよびT2強調イメージを測定し、そのデーターを基に最大シグナル強度投影（MIP）イメージを作成しました。前の図の説明を参考にすると、 T1強調MIP: 糖が集積した部位である、篩管を通して糖が輸送されるので 維管束に沿って糖が蓄積する細胞が強調される、 T2強調MIP: 導管に沿って細胞間隙に溢れた水が浸潤する部位が強調される だから、種子はハイライトされていない、 と説明することができます。両者を重ねると水が溜まった蜜入り部位の内側には糖が集積した細胞が存在する様子が明瞭に描写されました。維管束とその周辺の細胞は糖が溜まり甘くなります。しかし、細胞と細胞の間隙に溢れた半透明な組織を形成する原因の細胞間隙水は溢れた糖を大量な水で希釈するから甘くないということになります。同一の部位に生理作用が異なる二つの組織（細胞と細胞間隙）が存在することはキュウリの果実の場合と似ています。 果実形成の目的である種子が成熟すると果肉の役割が無くなることが本質です。そして、多くの果実が過熟（クリマクテリック）すると果肉の呼吸活性が急激に高まることと同様な現象が、リンゴでは蜜入りです。 |
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11．非破壊的な形態観察と連続測定 最初に述べたように、非破壊的に内部構造が観察できるということがMRIの最大の特徴であるとされています。植物の研究においても、それだけで充分に重要な意味を持つ場合があります。 ここでは、リンゴの着果直後の幼果（直径30mm）に食入したモモシンクイガ幼虫による被害を、同じ果実について、1T永久磁石の手作りのMRIによって幼虫孵化後10日（A、B）、15日（C）、20日（D）に時間を追って測定しました。10日目には1.8 mmの小さな幼虫（A）および他の5mm程度の幼虫が検出できました。15日目には幼虫はかなり大きくなり、一スライスに入らなくなりました（C）。さらに、20日目には成熟して果実を脱出しようとしている幼虫（→）が捕らえられました（D）。 Eは果実の果萼（下）部から上方に向かって、スライスイメージををムービーで繋いだものですが、幼虫が食入した軌跡を追跡することができます。 非破壊的に組織損傷の検査できることはMRIの大きな特徴で、医療においても脳挫傷や、骨折の検査に用いられています。 |
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MRIによる観察の特徴を （１） 水の状態（量と運動性）を通して組織の生理状態を推定できる （２） 組織に蓄積される特定な生理と関係する化合物を検出できる （３） ただ、非破壊的に解剖学的な内部組織を観察できる とする側面から捉えた場合の使い方について紹介しました。次は、現在、早稲田で行っている組織構造と生理機能をどのように結合するか？という課題を紹介します。 |
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１２．時間経過イメージングと機能 MRIの非破壊的特徴を活かした植物の機能解析についての話をします。 非破壊的に測定できるから（１）同一の試料を連続計測することが可能です。よって、サンプルのバラツキで隠れてしまうような微小変化をともなう現象を明確に捉えることができます。また、内部構造の変化を基に機能を推定することができます。これは、生体反応の実体ではなく結果として起こる形態変化を捉えているので、解釈に曖昧さが残ることが多いという問題があります。 そこで、（２）形態と生理を区別できるプローブ（探り針）を利用することが有効です。重金属イオン（マンガン）を利用したトウモロコシの茎における水の移動の例はすでに紹介しました。ここでは、検出の対象である水分子自体がトレーサーとなる測定の話をします。 （１）と（２）の性質によって、連続的に時間経過イメージを測定し、（３）ムービーメーカーを活用してリアルに構造変化および物質移動を追跡するという新しい展開ができます。これはビデオカメラと似た利用方法ですが、MRIの非破壊的性質により外観だけでなく内部構造が観察できます。 注意が必要なのは、現実のアプリケーションでは連続計測が効果的な課題の選択と測定セルや装置の工夫が重要な要素になります。 |
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構造変化が、そのまま生理的意味を持つ課題から始めます。 大豆は外皮が弱く乾燥すると破れやすいので、発芽、あるいは、調理のために吸水する際に子葉の損傷が起き、その結果、発芽率の低下や、漬けた水の白濁を招くことが問題とされています。Soakingeffectと言われます。そこで、外皮の存在意義を明らかにするために、（上）外皮を除去した大豆、（下）未処理の大豆について吸水の時間分割（時間経過）イメージを測定しました。イメージは連続的に15分間で測定されています。外皮を除去すると1時間半くらいで子葉がバラバラに砕けて落ちましたが、外皮が健全であれば、水は外皮から水和して、その後に豆が膨らむ様子を捉えることができます。よって、構造変化を基に種皮がプロテクターの役割を果たしていることが分かります。 この測定では、手法としてSingle point imaging法と連続3D計測という高度な測定技術が用いられています。その他に、楽に100μmの分解能を達成できる検出器、および、試験管に水を注入して即時に測定が開始できる測定セルなどの工夫、自動的に同じ測定を繰り返すためのプログラムが開発されたことによって成立しています。 |
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このようにして測定した立体的連続イメージから或る特定な断面を選び、時間を追って画像ファイルを作製して、それをスタックしてムービーにします。この際の画像処理作業は、ただ、ただ根気がいる単調な仕事です。 そのようにして作製したムービーでは、外皮を除去する（右）と子葉が短時間で破壊される過程が明確に捉えられました。一方、正常な豆（左）では、先ず、外皮が膨潤し、その次に胚軸および幼根が膨らんだ後に、子葉が急速に膨らむ様子が明瞭に捉えられています。このような測定は、2000年代になって画像解析プログラムとムービーメーカーを簡単に利用できるようになったことで可能になりました。私たちの論文は2006年に始めてムービーを利用しました。 高度なMRI測定手法と現代の可視的表現の結合です。よく知られている研究として、人が見たり、聞いたりしているとき脳のどの部分が反応しているかを調べる機能イメージングという分野で使われている技術です。 |
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前の測定にはRuan and Litchfield (1992)によって考案された理論的に大変オシャレなテクニックが使用されています。 具体的には、図のDのように乾燥した豆を竹の棒に貼り付けてガラス試験管に吊し、水を注いで直ちに強いT1強調条件で測定すると、60分（左）および100分（右）後に右のようなイメージが得られます。画像処理でサイド（E）の方向から見た大豆中央の縦スライスイメージとシグナル強度のプロファイルを示しました。ａは試験管外の空間のシグナル強度、ｂは浸漬水のシグナル強度、ｃは豆が水を吸収した組織のシグナル強度、ｄは豆の水を吸収していない組織のシグナル強度で、水が豆に浸入した部分ダケが強くなることが分かります。 ここで、浸漬用の自由水より豆に吸収された水のシグナルが強くなるのは、種子組織への吸着によって水分子の運動が束縛されてT1が短くなる、そして、ラジオ波の繰り返し照射によるスピン励起の飽和が起こらなくなるという理論的考察を基礎としています。そのために、吸収される水分子自身が水分子の移動を示すトレーサーとなるというユニークな測定法であり、植物以外でも乾燥物質に水が吸収される過程を追跡するために有効に使えます。 |
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例えば、炊飯の時に精白したコシヒカリを水に漬ける場合を模倣しました。精白米は胚芽と糠層を完全に除去してあり、生物活性は持っていません。右の時間を追ったイメージで、10分後には上下二カ所にヒビが入りました。ヒビは、吸水で膨潤する性質を持つデンプンの塊に急に水が入った時、組織間に起こる僅かな膨張率の差によって生じます。その後、中間にできたヒビからさらに上下に向かってヒビが入り、30分頃に一面に水が侵入しました。完全に米粒が膨らむためには約一時間が必要でした。 前の大豆で話したように、穀実は長く保存するほど乾燥してヒビ割れしやすく品質が低下する性質を有します。お米も同じで、乾燥の度合いが強くなるほどヒビ割れします。しかし、普通の乾燥状態であれば、炊飯している間に、吸水でできたヒビは互いにくっつくとされています。 |
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豆の吸水に戻ります。豆は、世界的に主要な穀物ですが、農業生産上、二つ重大問題が有りました。 （１） 播種時、長期保存した種子は子葉や胚軸が欠け、発芽率が低下する・・・Soaking damageといわれる。 （２） 種皮が硬く発芽しにくくなる・・・ 石豆（休眠の類？）ともいわれています。 以上の問題について、豆に水を吸収させた時、何処から水が取り込まれ、どのような経路で組織を水和するかという過程を明らかにすることが、障害のメカニズムを解析するために重要であると考えられています。（１）については、何時、どのように組織が破壊されるか？（２）については休眠種子では、覚醒に際して種皮のどの部分が最初にソフト化されて吸水チャンネルになるか？ということに興味が集まっていました。 右のイメージは、Rajmaというインド産のインゲン豆の吸水時の時間経過イメージを示しています。水は豆の上部から子葉の内側および外側の皮層に浸入し、表側（内側）から子葉の内部に広がることが分かりました。インゲンは表皮が柔らかく短時間で水を吸収するので、水の浸入の全過程を詳細に追跡することには向いていませんでした。 |
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種皮の硬いアズキを使用すると、吸水開始までに長い時間が掛かるので吸水ポイントを的確にとらえることができました。最初に水が浸入するのは右上の形態の写真において、ヘソの下にあるLensと言われる組織です。下のイメージは①が側面、②は正面の吸水過程です。 測定開始後、暫くしてレンズに強いシグナルが認められ、さらに時間をおいて水のシグナルが豆の内側に浸入し、豆は固定された部位を支点として一次的に傾斜しました。レンズ機能の活性化に大分長い時間がかかること、水の浸入初期に組織の一部が急に膨張するので豆が傾くことが分かります。 |
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解析には大分忍耐のいる繰り返し画像解析作業を必要としますが、時間経過イメージデーターを基に吸水変化を定量的に扱うことが可能です。アズキは長いLag phase（誘導期）の後に吸水を開始します。Lensの活性化には約10時間程度の時間が掛かります。しかし、吸水を開始すると急に速度が高くなり（Log phase：対数期）、続いて15時間を過ぎると吸収速度が鈍くなって、17時間くらいで一杯に膨潤して静止期（Stationary phase）に達します。このように、画像データーから或る側面を抽出して数値化することによって、変化の過程を、これまでに得られた他の手法による結果と照合することが出来ます。 沢山のデーターを取り込んで、後で解析する訳ですけど、その時に、どのように画像処理を行い、どのような指標を抽出するか？ということが結果の成否を左右するという点で難しいと思われます。 |
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種子発芽を詳細に観察することには、前に述べたように発芽率を確保すること、種子の活力を保持すること、適切な発芽環境を整えることなど農業上では重要な意味があります。 測定理論的には、測定条件を適切に選択することによって吸着水からのシグナルだけを強調して区別できる、さらに、連続測定とムービーによって吸水の進行にともなう体内の形態変化と生体反応の推移を非破壊的に観察できるという二点を上手く応用したと思います。 さらに、測定データーを適切に処理して数値化することで定量的解析をします。その場合に、測定目的に即して如何に表現するか？ということが大切で、 （１）視覚的表現 ： ムービー化 分かりやすいけど意図したポイントがボヤける （２）画像処理による時間経過変化の数値化： 極めて長い処理時間を要する という性質を認識して、最適な表現方法を模索してゆかなければなりません。 |
Ⅰ. 古典的理論：門司・佐伯の理論 へ
| 東巴のギャラリー ２ |
冬の旅 |
春の光のなか 花のスライドを見た老人がブツブツと・・・・・「なるほど頭は春か！これはお前の学校のことだ、・・・・・メロディーをもとにオーケストレーションするのも、オーケストレーションを優先させてメロディーを浮き上がらせるのも、テクニックとしてはアリか？？」など。どうも、ロマン派の音楽のことらしいのですが、交響曲を聴く習慣がない私には何のことだか、チンプンカンプン？？？・・・「写真も研究の手段だし、論文に載せる写真を撮るのがお前の仕事だから大げさなものでなくて、道ばたの舗装が割れた線とか、壁のヒビとかを撮れば良いんだ」と。 この話は日常の全てに及んでいたようです。論文を書く時、「どれもが均一の重さであることが良い訳ではない、重心は何処にあるんだ？」などと言われ続けてきました。最近になって「全く焦点が合っていない」ということらしいと思うに至りました。老人はハッキリした線画のように対象を捉えようとするのに、私は子供が色紙をちぎってバラ撒いたようなものしか作らないと・・・・・ |
「望遠レンズと逆光を使って、まだ力がない春の日を表現したようだけど、よほど狙いを絞らないと何を撮ったのかは分らなくなるよ」・・・・・論文には使えないという意味でしょうか。 春を撮りました。 |
木の芽どき 私の学生時代の研究は、ススキの原における植物種の多様性の調査でした。これを聞いた老人は、「ススキ、それは良い」と・・老人にとっての豊かさとは、「黒い大地に何処までも続くススキの原」。秋深く、筑波山の麓の櫻川に掛かる橋を渡った時「凍れる月影の下、湿った風に騒ぐススキの穂」との所望。 写真に撮ると肉眼では見えなかった傷とか、線とか、表面の凸凹が見えるようになるから、そのような特徴を研究の手段として使う場合がある。 |
水辺にて |
